一、材料、試劑和儀器

    1、電子顯微鏡.

　　2、真空噴鍍儀.

　　3、干凈銅網.

　　4、火棉膠.

　　5、鉑銥合金.

　　6、醋酸鈾水溶液.

　　7、展開儲備液(0.1mg/L細胞色素C,1mol/L醋酸銨).

　　8、醋酸異戊酯.

　　9、純化的質粒DNA樣品.

　　10、滑石粉.

　　二、目的

　　觀察質粒DNA在顯微鏡下的形態(tài),掌握質粒DNA的電鏡制樣原理和方法.

   三、原理

　　球狀蛋白質一般都可以在低鹽溶液或蒸餾水表面形成不溶解的變性薄膜,若濃度合適,則肽鏈伸展形成蛋白質單分子層.一般用堿性蛋白質包圍帶負電的核酸分子,當?shù)鞍踪|展開時,核酸也隨之展開,核酸的形態(tài)結構將保持一定的完整性.然后將核酸分子撈到支持膜上,經過負染色,就可以在電鏡下觀察.

　　四、操作步驟

　　1、稱取3克火棉膠溶解于100ml的醋酸異戊酯中,制成3％的溶液.

　　2、用滴管吸取該液,滴1－2滴于清潔的水面上,當醋酸異戊酯揮發(fā)后,在水面上形成一層均勻的火棉膠膜.

　　3、用鑷子小心地將干凈的銅網間隔一定距離排列在膜上.

　　4、在這些銅網上輕輕覆蓋一張適當大小的濾紙,待濾紙濕潤后將濾紙連同銅網、火棉膠膜輕輕撈起,銅網向上放于一干凈培養(yǎng)皿中晾干備用.

　　5、將核酸樣品(濃度為5mg/ml-10mg/ml)加到展開溶液中,終濃度為1mg/ml-0.5mg/ml,作為上相液.

　　6、將重蒸水注入干凈的培養(yǎng)皿中,作為下相液.

　　7、將干凈的載玻片斜放在培養(yǎng)皿中,在水表面撒少量滑石粉,以指示單分子膜的展開情況.

　　8、取50ul左右的上相液,在離下相液表面1cm處輕輕滴到斜面上,使上相液緩緩觸及下相液表面并形成一層單分子膜.

　　9、用鑷子夾著銅網,膜面朝下,輕輕沾取下相液表面的核酸分子.用濾紙吸去多余的液體,晾干備用.

　　10、用醋酸雙氧鈾染色15分鐘,蒸餾水洗3次,每次10分鐘,晾干備用.

　　11、在真空噴鍍儀中用鉑銥合金投影,以進一步增加電子反差.

　　12、電鏡觀察.

本文關鍵詞: 顯微鏡,DNA

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